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親和層析蛋白純化系統操作步驟
發布時間:2018-05-17   點擊次數:1221次
親和層析蛋白純化系統是在以離子交換劑為固定相,液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行,或借助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。

親和層析蛋白純化系統操作步驟:
(1)將抗體與蛋白A或蛋白G微珠結合,一般使用的層析柱,每毫升濕的微珠大約可結合2mg的抗體。將抗體與蛋白A/G微珠混合,使其成為一種稀薄的漿狀。在10ml溶液總量中大約含lml微珠。輕輕振蕩混勻,室溫孵育1h。
親和層析蛋白純化系統一般用單抗或經過親和純化的多抗制備??梢杂貌煌瑏碓吹目贵w,包括雜交瘤細胞培養上清液、腹水或純化的抗體溶液,由于與蛋白A/G微珠結合,可作為去除貯存緩沖液或交換緩沖液中其他物質的步驟。
如果需知道與微珠結合抗體的準確濃度,在與微珠結合之前應對抗體進行純化。
(2)用10倍體積的0.2mol/L硼酸鈉緩沖液洗滌微珠2次,以3000g離心5min,或10000g離心30s。
(3)用10倍體積的0.2mol/L硼酸鈉重懸微珠,并取出相當于10u1微珠的混懸液。加足量的DMP至終濃度為20retool/L。
如用DMP交聯,應為pH8.3以上。
(4)輕輕混勻,室溫孵育30min,取出相當于10txl已偶聯的微珠。
(5)用0.2mol/L乙醇胺洗滌微珠1次,以終止反應。然后用0.2mol/L懸微珠,室溫孵育2h,輕輕混勻。
(6)再次洗滌后,用含0.01%硫柳汞的PBS重懸微珠。
(7)檢測微珠樣品與抗體結合前后的結合效率,將樣品分別加入Laemmli樣品緩沖液中煮沸。分別取出相當于1/Il和9btl的兩種樣品,在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳,用考馬斯亮藍染色。結合前樣品呈現重鏈區帶而結合后樣品則無,表明交連成功.

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