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金屬螯合蛋白純化系統的具體使用方法
發布時間:2018-11-22   點擊次數:1061次
金屬螯合蛋白純化系統使用方法
對于通過AKTA純化系統純化,可直接連接預裝柱使用:對于一般紫外檢測,可通過產品附帶的魯爾接口將蠕動泵、橡膠管、魯爾接口、預裝柱、紫外檢測器連接,操作簡單,快捷。
①平衡
鎳螯合瓊脂糖凝膠柱用2~5個柱體積的初始緩沖溶液進行平衡。
建議線性流速為100cm/h。
②上樣
(1)樣品一般溶解于pH6~8的初始緩沖液中。提高上樣緩沖液的pH值可以增大載量。
(2)緩沖液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽,同時避免巰基乙醇、DTT等還原劑。
(3)常用緩沖液有10~100mM磷酸鈉緩沖液、20~200mMTris-HCl緩沖液等。
(4)緩沖液中一般要加入0.15~0.5M的NaCl以消除離子交換作用。
(5)初次使用鎳螯合瓊脂糖凝膠時,推薦使用50mMPBS作為初始緩沖液。
③洗脫
(1)增加咪唑濃度進行洗脫是鎳螯合瓊脂糖凝膠常用的洗脫方法。
(2)咪唑為堿性,相應緩沖液配制后需要用HCl調節pH值。
(3)初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF時,如不確定洗脫需要的咪唑濃度,推薦在初始緩沖液中加入咪唑,濃度從低
到高分別洗脫和收集重組蛋白,之后通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結果。
(4)有條件的可以進行咪唑梯度線性洗脫以確定較佳的洗脫條件。
洗脫方法
(1)降低pH洗脫:大多數蛋白在pH6~4會被洗脫下來,緩沖液可以是醋酸鈉、檸檬酸和磷酸鹽緩沖體系。
(2)競爭性洗脫:線性增加或一步增加同金屬離子有親和力的競爭物質的濃度。梯度洗脫在起始緩沖液的恒定pH值下進行。
(3)螯合劑洗脫:EDTA、EGTA等螯合劑可同金屬離子產生作用力,導致蛋白被洗脫下來。此法不能分離不同的蛋白,還會影響蛋白的吸附,導致融合蛋白無法掛柱。
注:降低pH洗脫和螯合劑洗脫會使得金屬離子脫落,下次使用前需要重新螯和金屬離子。常用的方法為競爭性洗脫。

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