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金屬螯合蛋白純化系統的具體使用方法
發布時間：2018-11-22 點擊次數：1061次
金屬螯合蛋白純化系統使用方法
對于通過AKTA純化系統純化，可直接連接預裝柱使用：對于一般紫外檢測，可通過產品附帶的魯爾接口將蠕動泵、橡膠管、魯爾接口、預裝柱、紫外檢測器連接，操作簡單，快捷。
①平衡
鎳螯合瓊脂糖凝膠柱用2~5個柱體積的初始緩沖溶液進行平衡。
建議線性流速為100cm/h。
②上樣
（1）樣品一般溶解于pH6~8的初始緩沖液中。提高上樣緩沖液的pH值可以增大載量。
（2）緩沖液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽，同時避免巰基乙醇、DTT等還原劑。
（3）常用緩沖液有10~100mM磷酸鈉緩沖液、20~200mMTris-HCl緩沖液等。
（4）緩沖液中一般要加入0.15~0.5M的NaCl以消除離子交換作用。
（5）初次使用鎳螯合瓊脂糖凝膠時，推薦使用50mMPBS作為初始緩沖液。
③洗脫
（1）增加咪唑濃度進行洗脫是鎳螯合瓊脂糖凝膠常用的洗脫方法。
（2）咪唑為堿性，相應緩沖液配制后需要用HCl調節pH值。
（3）初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF時，如不確定洗脫需要的咪唑濃度，推薦在初始緩沖液中加入咪唑，濃度從低
到高分別洗脫和收集重組蛋白，之后通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結果。
（4）有條件的可以進行咪唑梯度線性洗脫以確定較佳的洗脫條件。
洗脫方法
（1）降低pH洗脫：大多數蛋白在pH6~4會被洗脫下來，緩沖液可以是醋酸鈉、檸檬酸和磷酸鹽緩沖體系。
（2）競爭性洗脫：線性增加或一步增加同金屬離子有親和力的競爭物質的濃度。梯度洗脫在起始緩沖液的恒定pH值下進行。
（3）螯合劑洗脫：EDTA、EGTA等螯合劑可同金屬離子產生作用力，導致蛋白被洗脫下來。此法不能分離不同的蛋白，還會影響蛋白的吸附，導致融合蛋白無法掛柱。
注：降低pH洗脫和螯合劑洗脫會使得金屬離子脫落，下次使用前需要重新螯和金屬離子。常用的方法為競爭性洗脫。
