蛋白純化系統常用技術

1、沉淀

2、電泳：蛋白質在高于或低于其等電點的溶液中是帶電的，在電場中能向電場的正極或負極移動。根據支撐物不同，有薄膜電泳、凝膠電泳等。

3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。

4、層析：

a.離子交換層析，利用蛋白質的兩性游離性質，在某一特定PH時，各蛋白質的電荷量及性質不同，故可以通過離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析，含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來。

b.分子篩，又稱凝膠過濾。小分子蛋白質進入孔內，滯留時間長，大分子蛋白質不能同時入孔內而徑直流出。

5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開。

 

蛋白純化系統的一般程序可分為以下幾個步驟：

材料的預處理及細胞破碎

分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：

1.機械破碎法

這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。

2.滲透破碎法

這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。

3.反復凍融法

生物組織經凍結后，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法。

4.超聲波法

使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。

5.酶法

如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

 

蛋白質的抽提

通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑，使膜結構破壞，利于蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。