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蛋白純化系統常用技術和程序步驟
發布時間:2017-08-10   點擊次數:1045次
蛋白純化系統常用技術
1、沉淀
2、電泳:蛋白質在高于或低于其等電點的溶液中是帶電的,在電場中能向電場的正極或負極移動。根據支撐物不同,有薄膜電泳、凝膠電泳等。
3、透析:利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。
4、層析:
a.離子交換層析,利用蛋白質的兩性游離性質,在某一特定PH時,各蛋白質的電荷量及性質不同,故可以通過離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析,含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來。
b.分子篩,又稱凝膠過濾。小分子蛋白質進入孔內,滯留時間長,大分子蛋白質不能同時入孔內而徑直流出。
5、超速離心:既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開。
 
蛋白純化系統的一般程序可分為以下幾個步驟:
材料的預處理及細胞破碎
分離提純某一種蛋白質時,首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態,不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有:
1.機械破碎法
這種方法是利用機械力的剪切作用,使細胞破碎。常用設備有,高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。
2.滲透破碎法
這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。
3.反復凍融法
生物組織經凍結后,細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便,但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法。
4.超聲波法
使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。
5.酶法
如用溶菌酶破壞微生物細胞等。
 
蛋白質的抽提
通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑,使膜結構破壞,利于蛋白質與膜分離。在抽提過程中,應注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質的變性。

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